Chapitres
La constitution des bactéries
En plus de leur chromosome de 4 millions de paires de bases, les bactéries possèdent généralement de petites molécules d'ADN circulaire dont la taille varie entre 1 kb et 200 kb. Ces minichromosomes ou plasmides se répliquent et se transmettent indépendamment du chromosome bactérien, mais ils dépendent des protéines et enzymes de leur hôte pour leur réplication et la transcription de leurs gènes. Fréquemment, ils portent des gènes codant des enzymes qui dans certaines circonstances rencontrées dans la nature confèrent un avantage à l'hôte bactérien.
Parmi ces propriétés avantageuses, il y a la résistance à des antibiotiques, la production d'antibiotiques, la dégradation de composés organiques complexes ainsi que la production de colicines, d'entérotoxines et d'enzymes de restriction et modification. Que ces gènes aient été trouvés sur des plasmides plutôt que sur le chromosome bactérien n'est pas dû au hasard. Comme ces gènes sont localisés sur des plasmides présents dans la cellule en plusieurs copies, leur nombre est beaucoup plus important que s'ils étaient localisés sur le chromosome. Comme l'ADN plasmidique est de beaucoup plus petite taille que n'importe quel ADN chromosomique même très fragmenté, il est facilement séparable du reste du matériel génétique..
La structure du plasmide : On peut obtenir de grandes quantités de plasmide très pur. L'ADN plasmidique extrait d'une bactérie se trouve principalement sous une forme surenroulée. L'ADN surenroulé adopte une configuration plus compacte que l'ADN sous forme relâchée et il migre donc plus vite que ce dernier lors d'électrophorèse en gel d'agarose.
La transformation des bactéries
La tranformation des bactéries : D'une façon générale, une cellule bactérienne donnée ne contient qu'un seul type de plasmide. Au laboratoire, il existe plusieurs méthodes pour introduire un plasmide dans une bactérie. On ajoute l'ADN plasmidique à des bactéries traitées au CaCl2 et on soumet l'ensemble à un bref choc thermique. Ce procédé est appelé transformation.
Ce procédé soumet les bactéries en suspension dans de l'eau à une différence de potentiel élevée pour ouvrir temporairement des pores dans la paroi des cellules. L'efficacité de transformation est inversement proportionnelle à la taille du plasmide. C'est la raison pour laquelle on préfère transformer des plasmides de petite taille.
Dans les meilleures conditions, les plasmides ne se maintiennent que dans une minorité de la population bactérienne. Pour identifier les bactéries transformées, on utilise des marqueurs de sélection portés par le plasmide. Les marqueurs de sélection les plus utilisés sont les gènes de résistance à des antibiotiques, comme l'ampicilline, la tétracycline, le chloramphénicol et la kanamycine. Par la suite, les bactéries transformées sont cultivées en présence de l'antibiotique de manière à éviter que la bactérie ne perde le plasmide qu'on y a introduit.
Le réplicon : L'élément génétique qui contrôle le nombre de copies du plasmide se trouve dans une région de l'ADN plasmidique qui inclut l'origine de réplication. L'origine de réplication et les éléments de contrôle associés définissent une unité génétique appelée « réplicon ».
Des plasmides à contrôle de réplication relâché se multiplient dans les cellules jusqu'à ce que chaque cellule ait en moyenne 10 à 200 copies du plasmide. Au contraire, des plasmides à contrôle de réplication strict (« stringent ») se répliquent en même temps que le chromosome bactérien et ne sont donc présents qu'à raison d'une ou de quelques copies par cellule.
Le principe du clonage: Le principe du clonage est simple. Il consiste à insérer un segment d'ADN étranger dans une petite molécule capable de se répliquer de façon autonome. Ce type de molécule d'ADN est appelé un vecteur d e clonage.
Un vecteur de clonage courant est le plasmide bactérien. L'ADN du plasmide est coupé par une enzyme de restriction et lié in vitro au fragment d'ADN étranger coupé par la même enzyme de restriction ou une enzyme qui donne des extrémités compatibles.
Les molécules d'ADN résultantes sont transformées dans des bactéries.
Il est crucial de pouvoir distinguer entre les colonies qui contiennent des plasmides recombinants et celles qui contiennent les non recombinants, c'est-à-dire entre plasmides qui contiennent l'ADN étranger et plasmides qui se sont refermés sans prendre cet ADN étranger. Lorsqu'un transformant stable a été obtenu, la séquence est dite clonée.
Pour être de bons vecteurs de clonage :
- les plasmides doivent être petits et se répliquer sous contrôle relâché. La plupart des plasmides utilisés actuellement portent un réplicon dérivé du plasmide pMB1, qui a été isolé d'un échantillon clinique. Dans des conditions normales de culture, on trouve un minimum de 15 à 20 copies du plasmide portant ce réplicon dans chaque cellule bactérienne.
- ils doivent porter des marqueurs génétiques particuliers, comme des gènes de résistance aux antibiotiques ou le gène codant la ß-galactosidase.
- ils doivent porter un ou plusieurs sites de restriction uniques dans une région qui n'est pas essentielle pour la réplication des plasmides.
- et si possible, ils doivent avoir des sites de restriction uniques dans des gènes codant des marqueurs sélectifs. Ces marqueurs sont inactivés lorsqu'on y insère un fragment d'ADN étranger.
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c’est trop cool j’aime ce document meme je pas trop compris